Šis pirmasis driežo genetinės manipuliacijos atvejis sukūrė pavyzdinį organizmą, kuris galėtų padėti geriau suprasti roplių evoliuciją ir vystymąsi.
CRISPR-Cas9 arba tiesiog CRISPR yra unikalus, greitas ir nebrangus genas redagavimo įrankis, leidžiantis redaguoti genomą ištrinant, pridedant ar keičiant DNR. CRISPR akronimas reiškia „Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats“. Šis įrankis yra paprastas ir tikslesnis nei ankstesni redagavimo metodai DNR.
CRISPR-Cas9 įrankis suleidžia organizmus zigotinėje (vienaląstelėje) stadijoje su DNR konstrukcija, sudaryta iš (a) Cas9 fermento, kuris veikia kaip „žirklės“ ir gali iškirpti arba ištrinti dalį DNR, (b) nukreipianti RNR – seką, kuri atitinka tikslinį geną ir taip nukreipia Cas9 fermentą į tikslinę vietą. Kai nupjaunama tikslinė DNR dalis, ląstelės DNR taisymo mechanizmai vėl prisijungs prie likusios grandinės ir tuo metu nutildys tikslinį geną. Arba genas gali būti „pataisytas“ naudojant naują modifikuotą DNR šabloną, vadinamą homologija nukreiptu taisymu. Taigi, CRISPR-Cas9 įrankis leidžia atlikti genetines modifikacijas švirkščiant genų redagavimas tirpalai į vienaląstę apvaisintą kiaušinėlį. Šis procesas sukelia genetinį pakitimą (mutaciją) visose vėlesnėse ląstelėse, kurios gaminamos ir taip paveikia genų funkciją.
Nors CRISPR-Cas9 įprastai naudojamas daugeliui rūšių, įskaitant žuvis, paukščius ir žinduolius, iki šiol jam nepavyko genetiškai manipuliuoti ropliais. Taip yra visų pirma dėl dviejų kliūčių. Pirma, roplių patelės ilgą laiką saugo spermą savo kiaušintakyje, todėl sunku nustatyti tikslų apvaisinimo laiką. Antra, roplių kiaušinių fiziologija turi daug ypatumų, pavyzdžiui, lankstūs kiaušinių lukštai, trapumas, kai viduje nėra oro erdvės, todėl sunku manipuliuoti embrionais nesukeliant plyšimo ar žalos.
Įkeltame straipsnyje bioRxiv 31 m. kovo 2019 d. mokslininkai pranešė apie CRISPR-Cas9 naudojimo būdo kūrimą ir bandymą. genų redagavimas ropliuose pirmą kartą. Tyrime pasirinkta roplių rūšis buvo atogrąžų driežas vadinamas Anolis sagrei arba dažniausiai rudasis anolis, plačiai paplitęs Karibų jūros regione. Tyrime dalyvavę driežai buvo surinkti iš laukinio regiono Floridoje, JAV. Ši rūšis idealiai tinka tyrimui dėl savo miniatiūrinio dydžio, ilgo veisimosi sezono ir palyginti trumpo vidutinio laiko tarp dviejų kartų.
Siekdami įveikti apribojimus, su kuriais šiuo metu susiduria ropliai, mokslininkai CRISPR komponentų mikroinjekcija į nesubrendusius neapvaisintus kiaušinėlius, kol kiaušinėliai prieš apvaisinimą dar buvo patelių driežų kiaušidėse. Jie buvo nukreipti į tirozinazės geną, kuris gamina fermentą, kuris kontroliuoja driežų odos pigmentaciją, ir jei šis genas būtų pašalintas, driežas gimtų albinosu. Šis aiškus pigmentacijos fenotipas buvo priežastis pasirinkti tirozinazės geną. Mikroinjekciniai kiaušinėliai tada subręsta patelės viduje ir vėliau natūraliai apvaisinami su įvestu patinu arba saugomu spermatozoidu.
Dėl to po kelių savaičių gimė keturi driežai albinosai, patvirtinantys, kad geno tirozinazė buvo deaktyvuota ir genų redagavimas procesas buvo sėkmingas. Kadangi palikuonys turėjo redaguotą abiejų tėvų geną, buvo aišku, kad CRISPR komponentai daug ilgiau išliko aktyvūs nesubrendusiame motinos oocite ir po apvaisinimo mutavo tėvo genai. Taigi, mutantiniai driežai albinosai rodė manipuliuojamą tirozinazę genuose, paveldėtuose tiek iš motinos, tiek iš tėvo, nes albinizmas yra iš abiejų tėvų paveldėtas bruožas.
Tai pirmasis tyrimas, kurio metu buvo efektyviai auginami genetiškai modifikuoti ropliai. Tyrimas galėtų būti panašus su kitomis driežų rūšimis, pavyzdžiui, gyvatėmis, kurių dabartiniai metodai iki šiol buvo nesėkmingi. Šis darbas galėtų padėti geriau suprasti roplių evoliuciją ir vystymąsi.
***
{Šis tyrimas šiuo metu pateiktas tarpusavio peržiūrai. Galite perskaityti išankstinio spausdinimo versiją, spustelėję toliau pateiktą DOI nuorodą cituojamų šaltinių sąraše}
Šaltiniai)
Rasys AM ir kt. 2019. Išankstinis spausdinimas. CRISPR-Cas9 Genų redagavimas driežuose per neapvaisintų kiaušialąsčių mikroinjekciją. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
